Pureza por HPLC x espectrometria de massas

Dois resultados que respondem a perguntas diferentes

Um laudo de análise de peptídeos costuma trazer dois resultados analíticos lado a lado: um percentual de pureza obtido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e um resultado de espectrometria de massas (MS). A HPLC separa os componentes de uma amostra e informa quanto do sinal detectado fica no pico principal. A MS mede a massa das moléculas presentes e mostra se foi encontrada uma massa compatível com o composto esperado. Leia cada resultado pelo que ele mede; um não substitui o outro.

O que significa um percentual de pureza por HPLC

Na HPLC de fase reversa, a amostra dissolvida passa por uma coluna empacotada e seus componentes saem em tempos diferentes. Um detector, geralmente de absorbância UV em um comprimento de onda em que as ligações peptídicas absorvem, registra cada componente como um pico. O número de pureza costuma ser a área do pico principal dividida pela área total de todos os picos integrados.

Esse cálculo tem limites. Ele conta apenas o que o método separa e o detector vê: uma impureza que sai da coluna junto com o pico principal, ou que quase não absorve no comprimento de onda escolhido, não reduz o número. Água e contraíons nem aparecem como picos de peptídeo, então a pureza não é a fração do peso do pó que é peptídeo. O número também depende do método (coluna, gradiente, comprimento de onda e parâmetros de integração), por isso deve ser lido com a especificação do próprio laudo e, quando disponível, com o cromatograma. Guarde estes dados com cada número de pureza:

• O método indicado no laudo, como HPLC ou LC-MS.
• A especificação do próprio laudo para esse resultado.
• O cromatograma, se você precisar ver os picos.

O que significa um resultado de espectro de massas

A espectrometria de massas converte as moléculas em íons carregados e mede sua razão massa/carga. Peptídeos analisados por ionização por electrospray costumam ter mais de uma carga, de modo que uma mesma molécula pode gerar vários sinais. Na notação dos laudos, [M+2H]2⁺ é a molécula com dois prótons adicionados e [M-H]- é a molécula com um próton a menos.

Para BPC-157, o perfil do composto indica a fórmula C62H98N16O22 e massa monoisotópica de 1418.7042 Da. Com isso, espera-se um íon [M+2H]2⁺ perto de m/z 710.36 e um íon [M-H]- perto de m/z 1417.70. O laudo BC10 informa o resultado como “Detected” frente à especificação “Conforms to [M+2H]2⁺, [M-H]-” e não imprime valores de m/z. Se a sua revisão precisar dos valores observados, peça o espectro.

Uma massa coincidente é uma boa evidência de que a molécula esperada está presente, mas o resultado é qualitativo. Ele não diz quanto da amostra é essa molécula, e moléculas com a mesma fórmula, como um peptídeo com dois resíduos trocados de posição, têm a mesma massa. Confirmar a própria sequência exige outras técnicas, por exemplo a fragmentação em espectrometria de massas em tandem (MS/MS).

Leia os dois resultados juntos

Pureza e massa só se apoiam quando descrevem a mesma amostra. Em uma análise LC-MS acoplada, a massa é medida nos picos que estão sendo separados, o que liga os dois resultados mais de perto do que dois testes independentes. O laudo de ARA-290 10 mg COA-1AvcSX-K-0F, da PRISTINBIO (lote 20260905), segue o mesmo padrão do laudo BC10 com outra especificação: Peptide Purity (HPLC) 99.77 % frente a ≥ 98.0%, e Mass Spectrum “Detected” frente a “Conforms to structure”.

• Confira se os dois resultados indicam a mesma amostra e o mesmo lote.
• Mantenha cada resultado com seu método e sua própria especificação.
• Não transforme um percentual de pureza em quantidade, nem um resultado de massa “Detected” em pureza.

Mantenha os limites de cada laudo

Cada laudo cobre apenas a amostra e o lote nele impressos. Verifique-o no site do emissor e confira se o número de lote corresponde à mercadoria recebida.

O emissor (TJQXGD) declara que os dados vêm de um laboratório parceiro terceirizado, que nem ele nem o laboratório possuem acreditação CMA/CNAS e que este documento não tem validade de certificação legal. O emissor (PRISTINBIO) declara que a análise é apenas informativa e se refere à amostra enviada.

Peça os documentos do lote exato da sua cotação. Um laudo descreve apenas o lote analisado; confira se o número de lote corresponde ao lote que você recebe.