O que são endotoxinas
Endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPS), moléculas grandes que formam boa parte da membrana externa das bactérias gram-negativas, como a Escherichia coli. Elas são liberadas quando as bactérias crescem, se dividem ou morrem, e são muito estáveis: a autoclavagem comum não as destrói, a liofilização não as remove e elas atravessam os filtros de 0.2 µm usados para reter bactérias. Por isso um material pode ser estéril e ainda conter endotoxinas.
No laboratório, as endotoxinas importam porque quantidades muito pequenas ativam células imunes como os macrófagos, principalmente pelo receptor TLR4. Em cultura de células e em outros trabalhos com sistemas biológicos, a endotoxina trazida por um reagente pode alterar resultados que depois são atribuídos por engano ao material estudado.
De onde vêm as endotoxinas
Como a secagem não remove endotoxinas, o nível em um pó liofilizado reflete o que havia na solução antes da liofilização. As endotoxinas entram com tudo o que esteve em contato com bactérias:
- A água usada na síntese, na purificação ou no enxágue.
- Tampões, sais e outros reagentes.
- Vidraria, tubos e plásticos que não são fabricados livres de endotoxinas.
- O manuseio durante o envase e a embalagem.
Como funciona o teste LAL
O método de referência é o teste do lisado de amebócitos de Limulus (LAL). Seu reagente é obtido de células do sangue do caranguejo-ferradura, cujo sistema de coagulação é ativado pela endotoxina: a endotoxina ativa o fator C, que inicia uma cascata enzimática que termina em um coágulo. As versões do teste diferem na forma de ler essa reação.
Cada ensaio inclui padrões de endotoxina e uma verificação de que a própria amostra não inibe nem intensifica a reação, geralmente adicionando à amostra uma quantidade conhecida de endotoxina e medindo quanto é recuperado. Peptídeos, íons metálicos e pH extremos podem interferir, por isso os laboratórios costumam diluir a amostra até que a interferência desapareça.
| Método | O que é lido | Tipo de resultado |
|---|---|---|
| Gel-clot (coágulo em gel) | Se um gel firme se forma após a incubação. | Acima ou abaixo da sensibilidade declarada do reagente; uma série de diluições dá um valor de ponto final. |
| Turbidimétrico cinético | A rapidez com que a mistura fica turva. | Um valor lido em uma curva padrão. |
| Cromogênico | A cor amarela liberada por um substrato sintético. | Um valor lido em uma curva padrão. |
| Fator C recombinante (rFC) | A fluorescência de um substrato clivado pelo fator C recombinante. | Um valor lido em uma curva padrão, sem sangue de caranguejo-ferradura. |
Unidades de endotoxina: EU por frasco, por mg e por mL
Os resultados são dados em unidades de endotoxina (EU), uma medida de atividade em relação a uma endotoxina de referência; para o padrão de referência usual, 1 EU corresponde a cerca de 0.1 a 0.2 ng de endotoxina. Um resultado pode ser expresso por frasco, por miligrama de material ou por mililitro de solução. Para comparar um resultado por frasco com um limite por miligrama, divida-o pela quantidade de material no frasco, usando o teor medido se o laudo o informar.
Um resultado abaixo do ponto mais baixo da curva padrão é informado como menor que esse valor, por exemplo < 0.005 EU/mL, e não como zero. Não existe um limite único de endotoxinas para materiais de pesquisa: compare o resultado com o limite que o seu protocolo ou o seu sistema celular exige, na mesma unidade.
Os resultados de endotoxinas nos nossos laudos
Por exemplo, os laudos abaixo da nossa biblioteca de laudos incluem um resultado de endotoxinas. Cada um traz o resultado por frasco e uma quantidade medida de material, de modo que é possível calcular um valor por miligrama.
Esses laudos dão o resultado de endotoxinas sem uma especificação ao lado, então o resultado é uma medição, e não uma aprovação contra um limite. A coluna por mg da tabela é um cálculo nosso a partir dos dois valores impressos; ela não consta nos laudos. Se o seu trabalho depender do método, pergunte ao emissor qual foi usado.
O emissor (TJQXGD) declara que os dados vêm de um laboratório parceiro terceirizado, que nem ele nem o laboratório possuem acreditação CMA/CNAS e que este documento não tem validade de certificação legal. Cada laudo cobre apenas a amostra e o lote nele impressos. Verifique-o no site do emissor e confira se o número de lote corresponde à mercadoria recebida.
| Laudo | Endotoxinas, como impresso | Quantidade, como impressa | Por mg (nosso cálculo) |
|---|---|---|---|
| SNAP-8 10 mg, NP8 10-20260914S8218 | 0.259 EU/vial | Teor líquido 10.85 mg | cerca de 0.024 EU/mg |
| NAD+ 1000 mg, NAD1000-20260914S8218 | 1.156 EU/Vial | Teor líquido 1034.21 mg | cerca de 0.0011 EU/mg |
| Glutathione 1500 mg, GTT1500-20260907S7260 | 1.037 EU/Vial | Peso de peptídeo 1464.81 mg | cerca de 0.00071 EU/mg |
O que pedir quando as endotoxinas importam
Peça os documentos do lote exato da sua cotação. Um laudo descreve apenas o lote analisado; confira se o número de lote corresponde ao lote que você recebe.
- O resultado de endotoxinas do lote exato que você recebe, com a unidade.
- O método (gel-clot, turbidimétrico, cromogênico ou fator C recombinante) e a sensibilidade ou a faixa da curva padrão.
- Se a verificação de inibição e intensificação passou.
- O limite de que o seu protocolo precisa, na mesma unidade do resultado.
- Água, vidraria e plásticos livres de endotoxinas para o seu próprio trabalho, para não adicionar endotoxinas depois do recebimento.
Somente pesquisa laboratorial. Não destinado ao uso humano ou animal.