Что такое эндотоксины
Эндотоксины — это липополисахариды (LPS), крупные молекулы, из которых в значительной мере состоит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, например Escherichia coli. Они высвобождаются, когда бактерии растут, делятся или гибнут, и очень устойчивы: обычное автоклавирование их не разрушает, лиофилизация не удаляет, и они проходят через фильтры 0.2 µm, которыми задерживают бактерии. Поэтому материал может быть стерильным и всё же содержать эндотоксин.
В лаборатории эндотоксины важны потому, что очень малые их количества активируют иммунные клетки, например макрофаги, главным образом через рецептор TLR4. В клеточной культуре и других работах с биологическими системами эндотоксин, попавший с реагентом, может изменить результаты, которые затем ошибочно приписывают изучаемому материалу.
Откуда берётся эндотоксин
Поскольку высушивание не удаляет эндотоксин, его уровень в лиофилизированном порошке отражает то, что было в растворе до лиофилизации. Эндотоксин попадает с тем, что контактировало с бактериями:
- С водой для синтеза, очистки или промывки.
- С буферами, солями и другими реагентами.
- Со стеклянной посудой, трубками и пластиком, не изготовленными как апирогенные.
- При работе с материалом во время фасовки и упаковки.
Как работает ЛАЛ-тест
Стандартный метод — тест с лизатом амебоцитов Limulus (LAL, ЛАЛ). Его реагент получают из клеток крови мечехвоста, свёртывающая система которого запускается эндотоксином: эндотоксин активирует фактор C, который запускает ферментный каскад, заканчивающийся образованием сгустка. Варианты теста различаются тем, как они считывают эту реакцию.
Каждая серия включает стандарты эндотоксина и проверку того, что сам образец не подавляет и не усиливает реакцию: обычно к образцу добавляют известное количество эндотоксина и измеряют, сколько его обнаруживается. Пептиды, ионы металлов и крайние значения pH могут мешать анализу, поэтому лаборатории часто разбавляют образец, пока помеха не исчезнет.
| Метод | Что считывается | Тип результата |
|---|---|---|
| Гель-тромб-тест | Образуется ли плотный гель после инкубации. | Выше или ниже заявленной чувствительности реагента; серия разбавлений даёт значение конечной точки. |
| Кинетический турбидиметрический | Насколько быстро смесь мутнеет. | Значение, считанное по стандартной кривой. |
| Хромогенный | Жёлтая окраска, высвобождаемая из синтетического субстрата. | Значение, считанное по стандартной кривой. |
| Рекомбинантный фактор C (rFC) | Флуоресценция субстрата, расщеплённого рекомбинантным фактором C. | Значение, считанное по стандартной кривой, без крови мечехвоста. |
Единицы эндотоксина: EU на флакон, на мг и на мл
Результаты выражают в единицах эндотоксина (EU) — мере активности относительно эталонного эндотоксина; для обычного эталонного стандарта 1 EU соответствует примерно 0.1–0.2 ng эндотоксина. Результат может быть указан на флакон, на миллиграмм материала или на миллилитр раствора. Чтобы сравнить результат на флакон с пределом на миллиграмм, разделите его на количество материала во флаконе, используя измеренное содержание, если оно приведено в отчёте.
Результат ниже нижней точки стандартной кривой указывают как «меньше этого значения», например < 0.005 EU/mL, а не как ноль. Единого предела эндотоксинов для исследовательских материалов нет: сравнивайте результат с пределом, который нужен вашему протоколу или клеточной системе, в той же единице.
Результаты по эндотоксинам в наших отчётах
Например, приведённые ниже отчёты из нашей библиотеки содержат результат по эндотоксинам. В каждом указан результат на флакон и измеренное количество материала, так что можно рассчитать значение на миллиграмм.
В этих отчётах результат по эндотоксинам приведён без спецификации рядом, поэтому это измерение, а не соответствие пределу. Столбец «на мг» в таблице — наш собственный расчёт по двум напечатанным значениям; в отчётах его нет. Если ваша работа зависит от метода, уточните у выдавшей организации, какой метод применялся.
Выдавшая организация (TJQXGD) указывает, что данные получены от сторонней партнёрской лаборатории, ни она, ни лаборатория не имеют аккредитации CMA/CNAS, и документ не имеет юридической силы сертификата. Каждый отчёт относится только к указанным в нём образцу и партии. Проверьте его на сайте выдавшей организации и сверьте номер партии с полученным товаром.
| Отчёт | Эндотоксин, как напечатано | Количество, как напечатано | На мг (наш расчёт) |
|---|---|---|---|
| SNAP-8 10 mg, NP8 10-20260914S8218 | 0.259 EU/vial | Чистое содержание 10.85 mg | около 0.024 EU/mg |
| NAD+ 1000 mg, NAD1000-20260914S8218 | 1.156 EU/Vial | Чистое содержание 1034.21 mg | около 0.0011 EU/mg |
| Glutathione 1500 mg, GTT1500-20260907S7260 | 1.037 EU/Vial | Масса пептида 1464.81 mg | около 0.00071 EU/mg |
Что запросить, если эндотоксины важны
Запросите документы на ту партию, которая указана в вашем предложении. Отчёт описывает только проверенную партию, поэтому сверьте номер партии в нём с номером полученной партии.
- Результат по эндотоксинам для той партии, которую вы получаете, с единицей измерения.
- Метод (гель-тромб, турбидиметрический, хромогенный или рекомбинантный фактор C) и его чувствительность или диапазон стандартной кривой.
- Пройдена ли проверка на подавление и усиление.
- Предел, который нужен вашему протоколу, в той же единице, что и результат.
- Апирогенную воду, стеклянную посуду и пластик для вашей собственной работы, чтобы не внести эндотоксин после приёмки.
Только для лабораторных исследований. Не для применения у людей или животных.